LDT-性能验证指南学习笔记

1. 背景

2. 实验方法设计与优化

3. NGS 检测流程设计分析

4. 性能评估

1. 背景

    预期用途

    检测原理

2. 实验方法设计与优化

2.0 样本选择

2.1 Panel 相关基因位点的设计

    问题：探针或引物设计在哪些区域，检测哪些点的突变？ 依据是什么？

    答： 《NCCN指南》 确定变异检测类型，确定检测区域， 详见《Gene panel 相关整理》。

2.2  实验方法几个需要注意的点：

核酸提取质控

质控指标：核酸纯度，核酸浓度和完整性。

分析内容：按照试剂盒要求，提取含有不同浓度待测核酸的样本，其中

1. 核酸纯度：将核酸提取液用分光光度计测定 A260/280 比值。
   

2. 核酸完整性：按照试剂盒要求，提取含有不同浓度待测核酸的样本，核酸浓度宜覆盖厂家声明的可提取的核酸浓度，取一定量的核酸提取液进行琼脂糖凝胶电泳，与待测核酸标准物比较。

3. 核酸浓度质控：使用Qubit 对提取的核酸进行浓度的测定；

质控标准:

1. 核酸纯度：待测物质为 DNA 时，A260/280 比值在 1.7-1.9；待测物质为 RNA 时，A260/280 比值在 1.8-2.0。

2.  核酸完整性：在期待核酸分子量相应的位置可观察到清晰或弥散的条带， 无明显降解。
   

文库构建质控

质控指标：文库浓度，文库片段大小。

分析内容：按照试剂盒要求，进行文库的构建，包括，基因组DNA片段化、加A-tailing、加adapters（有的产品会添加UMI标签，进行单分子标记）、PCR富集、纯化等。

质控标准：

1. 使用Qubit、Q-pcr或者数字pcr方法定量文库浓度是否达到预期的范围；

2. 使用凝胶电泳或者DNA片段分析仪器定量文库片段大小是否达预期的范围( 无明显小片段或大片段杂峰)。

##实验方法：https://wenku.baidu.com/view/b7190974bb0d4a7302768e9951e79b8969026828.html

-- -- -- Q&A 质控不合格可能存在的原因以及解决的方案 后续整理

3. NGS 检测流程设计分析（略）

4. 性能评估

4.1 准确度（方法符合率）

1. 概念：阳性符合率， 阴性符合率

2. 样本：选取阴性样本至少 5 例、阳性样本（宜包含弱阳性/低扩增的样本）， 一般不少于 10 例样本。比如：阳性样本10， 待验证位点：112个（一个样本有可能多个位点）

3.  方法：按照患者样本检测程序，采用参比方法和候选方法平行检测。

将所有检测结果按下表汇总填表，计算符合率。（1. 检测类型；2. 检测水平（基因位点的变异）

阳性符合率=a/(a+c)×100%

阴性符合率=d/(b+d)×100%

总符合率=(a+d)/( a+b+c+d)×100%

4.2  紧精密度（重复性）

使用同一批次的FFPE标准品，分多次提取，验证提取效率；

使用同一批次的gDNA/ctDNA/RNA/fcDNA，重复建库，通过相同的文库检测指标，来衡量建库重复性；

使用同一批次的gDNA/ctDNA/RNA/fcDNA，一次建库，分批次上机，验证测序重复性；

相同的提取，建库，测序条件，使用不同的信息分析流程，验证流程的重复性；

4.3 检测下限验证（分析灵敏度的确定）

a. 概念：Lod 计算, 即 95%检出的最低突变频率（假如：1%， 5%）的浓度为检测下限。

（样本在某一核酸浓度，用我们的试剂或软件能检出的频率）最低突变频率 以及检出限浓度

b. 样本:

1.  定值标准物质（如标准品，已知突变丰度）

2. 数字PCR定量的阳性临床样本（同一基因变异类型（如：SNV，indel，CNV，SV）的检测， 已知突变丰度）

3.    给定验证的位点（假设 112 个位点）

c. 验证方法：

1. 通过稀释液（具体待定）配制成4个突变频率梯度（0.1%, 0.5%, 1%，5%）样本;

2. 每个样本在3种建库起始量（10ng, 30ng, 50ng）进行5次重复检测;

d. 判断标准

    如果是 5 次重复检测，必须 100%检出靶核酸；如果是 20 次检测，必须检出 至少 18 次靶核酸(95%)。

e.最后确定 最低突变频率(检出限浓度)

参考：

分子诊断检验程序性能验证指南

https://www.sbc.org.cn/upload/default/20191231/984d23764df335f35bf8769f010424a8.pdf

https://www.sohu.com/a/418787740_120554400